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科研進展

武漢病毒所等合作單位在布尼亞病毒核酸內切酶的催化和干預機制研究中取得系列進展

發表日期:2022-03-14來源:武漢病毒研究所放大 縮小
      近日,武漢病毒所/華中科技大學/南開大學聯合團隊在布尼亞病毒核酸內切酶的催化機制,以及基于結構的藥物干預機制研究中取得重要進展。兩篇相關研究成果“Insights into two-mietal-ion catalytic mechanism of cap-snatching endonuclease of  Ebinur Lake virus in Bunyavirales”,以及 “Structural and biochemical basis for development of diketo acid inhibitors targeting the cap snatching endonuclease of the Ebinur Lake virus (order: Bunyavirales)”相繼在線發表在Journal of Virology上。
      布尼亞病毒包含許多重要的人和動物病原,對公共健康和農牧業構成了嚴重威脅,目前尚未有針對該類病毒的疫苗和特異性治療藥物。艾比湖病毒(Ebinur Lake virus,EBIV)是近年在我國新疆艾比湖地區發現的一種新型蚊媒布尼亞病毒,前期研究結果表明EBIV對我國人口健康構成潛在生物安全風險。包括布尼亞病毒和流感病毒在內的分節段負鏈RNA病毒普遍利用一種獨特的“奪帽”機制來起始病毒的轉錄。奪帽過程由病毒編碼的L蛋白執行,該蛋白中段為依賴RNA的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRP),N端區域包含核酸內切酶(endonuclease,EN)結構域,C端區域包含帽子結合域(cap binding domain,CBD),在CBD的協同作用下,由EN實現宿主mRNA的切割。由于切割得到的含5'帽子結構的寡核苷酸被用作RdRP轉錄的引物,因此EN可作為重要的病毒干預靶點。
      研究團隊首先解析了一系列高分辨率(2.0-2.6埃)的EBIV EN野生型和活性位點突變體晶體結構,并結合體外核酸內切酶生化實驗,深入分析了EN活性位點結構與功能之間的關系。研究結果顯示,EBIV EN是一種二價金屬離子依賴的RNA核酸內切酶,能特異性切割富含尿嘧啶且不含二級結構的單鏈RNA,其酶活嚴格依賴活性位點兩個金屬離子的結合(圖1)。EBIV EN野生型和突變體蛋白的晶體結構分析進一步支持雙金屬離子催化機制,且兩個金屬離子在活性位點上的結合具有相關性。該研究為深入理解分節段負鏈 RNA 病毒核酸內切酶的工作機制提供了重要證據。 
 
圖1. EBIV EN的活性依賴于活性位點兩個二價金屬離子的結合。(A)EBIV EN活性位點區域的立體對象圖。(B)EBIV EN 野生型和活性位點突變體的核酸內切酶活性分析。
 
      在此基礎上,研究團隊進一步對EBIV EN的干預機制進行了研究。研究團隊首先以EN金屬螯合型抑制劑二酮酸類化合物L-742,001為原型,設計和合成了一系列衍生化合物,隨后結合酶學,病毒學和晶體學方法對這些化合物的構效關系進行了深入探究。研究結果表明,L-742,001及其9種衍生物能以不同程度抑制EBIV EN的體外酶活和細胞水平上的病毒復制。EN與抑制劑復合物晶體結構分析(圖2)進一步顯示,L-742,001的二酮酯基團通過金屬螯合作用占據EN的活性中心,對氯苯基團則與活性位點殘基形成穩定的疏水堆積作用,二者對其活性至關重要;其苯基由于結構上的靈活性和結合口袋的開放性,可以采用多種構象與活性位點相互作用,因此是最具優化潛力的基團。該研究揭示了L-742,001二酮酸類化合物干預 EN 的分子機制,為靶向分節段負鏈RNA病毒EN的廣譜抑制劑設計和優化提供了重要的科學依據。
 
圖2. L-742,001及其衍生物IN5, IN16與EBIV EN的結合模式。EBIV EN活性位點參與抑制劑結合的關鍵氨基酸以白色棍狀模型顯示,L-742,001及其衍生物以黃色棍狀模型顯示,錳離子以青色球體顯示。
 
      華中科技大學同濟醫學院法醫學系博士后匡文華為兩篇論文的第一作者;武漢病毒所龔鵬研究員/華中科技大學的周亦武教授、武漢病毒所胡志紅研究員/南開大學郭宇教授,分別為兩篇論文的共同通訊作者。研究得到了國家重點研發計劃(2018YFA0507200,2018YFA0507203)、中國科學院武漢國家生物安全實驗室高端用戶培育項目(2021ACCP-MS10,2020-NBL-ZD-00030,2018ACCP-ZD02),病毒學國家重點實驗室開放研究基金項目(2020IOV003),中國博士后科學基金(2018M632827),湖北江夏實驗室生物安全科技重點項目(JXBS001)和湖北省自然科學基金杰青項目(2021CFA050)等經費的支持。

文章鏈接:
1. https://doi.org/10.1128/jvi.02085-21
2. https://doi.org/10.1128/jvi.02173-21
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